對(duì)塑料污染的研究表明，這種威脅對(duì)我們星球的危險(xiǎn)程度正在與日俱增。海洋是絕大多數(shù)塑料垃圾的最終目的地。聚苯乙烯是熱塑性聚合物中使用廣泛的塑料之一，也是環(huán)境中觀察到的塑料碎片的主要成分之一，它可用于食品服務(wù)和食品包裝，因此可以直接包含在食物鏈中。在這項(xiàng)研究中，在胚胎期注射20納米大小的聚苯乙烯顆粒（PS）的斑馬魚在沒(méi)有塑料暴露的環(huán)境中生長(zhǎng)，在形態(tài)、分子和代謝組學(xué)水平上研究聚苯乙烯顆粒對(duì)其后代胚胎/幼魚的影響。

1.材料和方法
1.1斑馬魚飼養(yǎng)和PNP處理
試驗(yàn)中使用斑馬魚，總共300個(gè)胚胎，每次復(fù)制100個(gè)胚胎，注射聚苯乙烯納米塑料（PNP）。此外，用注射超純水的胚胎作為對(duì)照組。將注射的和對(duì)照的胚胎保存在胚胎培養(yǎng)基和28.5度的培養(yǎng)箱中直到第6天。從第6天開始，幼魚被帶到系統(tǒng)中的特殊幼魚槽中，并用特殊的幼魚飼料喂養(yǎng)到第15天。從第15天開始，每天給它們喂食并生長(zhǎng)6個(gè)月。直到6個(gè)月，注射PNP的斑馬魚的存活率與對(duì)照組相比沒(méi)有觀察到顯著差異。從對(duì)照組和注射組中隨機(jī)選擇10只雌性和20只雄性6個(gè)月大的斑馬魚，將它們放入繁殖池中，每個(gè)繁殖池中有2只雄性和1只雌性。每組至少獲得700個(gè)胚胎用于每次復(fù)制。將后代胚胎取入E3胚胎培養(yǎng)基中，觀察至第120小時(shí)。每24小時(shí)記錄一次所有后代斑馬魚的存活率、孵化率和身體異常。

1.2心跳、血流和運(yùn)動(dòng)活性測(cè)定
對(duì)于心跳和血流分析，從對(duì)照組和PNP治療組中隨機(jī)選擇10個(gè)120小時(shí)胚胎，在顯微鏡下進(jìn)行180秒的視頻記錄。視頻聚焦于心臟的心跳和尾靜脈的血流，然后轉(zhuǎn)移到諾達(dá)思的斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)分三個(gè)重復(fù)進(jìn)行。對(duì)于運(yùn)動(dòng)活性，從對(duì)照組和PNP處理組中隨機(jī)選擇24只幼魚，每只120小時(shí)，將其放置在24孔板上，每個(gè)孔中有一只幼魚，并將板放置在諾達(dá)思的斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)中。在馴化30分鐘后，將該系統(tǒng)調(diào)節(jié)至10分鐘間隔的黑暗和光明期50分鐘。在分析期間，通過(guò)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)評(píng)估幼魚的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)。對(duì)每組進(jìn)行三次重復(fù)的72只幼魚進(jìn)行分析。

1.3全程免疫熒光幼魚染色
為了研究親代PNP暴露對(duì)后代自由基形成、細(xì)胞凋亡和脂質(zhì)積累的影響，將達(dá)到120小時(shí)的新一代幼魚作為整體免疫熒光進(jìn)行分析。

1.4代謝組學(xué)
將來(lái)自對(duì)照組和PNP組的25個(gè)120hpf胚胎匯集在1ml微量離心管中（每組10個(gè)）。加入1ml甲醇以維持均化過(guò)程。之后，將提取物置于水浴中超聲處理約10分鐘。最后，將所有樣品以離心10分鐘。將上清液輕輕轉(zhuǎn)移到另一個(gè)微型離心管中，并在真空下抽吸直至干燥。通過(guò)100μl流動(dòng)相（去離子水：乙腈，包括%0.1甲酸）對(duì)樣品進(jìn)行重組。

2.結(jié)果和討論
根據(jù)本研究獲得的結(jié)果，觀察到與對(duì)照組相比，親代PNP暴露導(dǎo)致下一代幼魚的總體畸形（包括心包水腫、卵黃囊水腫、身體畸形/彎曲體軸）顯著增加（圖1 a和b段）。與注射胚胎（父母）相比，在后代幼魚中觀察到的畸形率低于在注射幼魚中觀察的畸形率（圖1b段）。同樣，觀察到親代PNP暴露會(huì)增加下一代幼魚的死亡率（圖1c），但考慮到注射的胚胎（親代），觀察到下一代幼體的存活率高于注射PNP的胚胎（父母）。另一方面，與對(duì)照組相比，孵化率沒(méi)有差異（圖1d）。PNP組的心包區(qū)域明顯增加（圖1e）。這種增加支持了觀察到的心包水腫。

圖1

在PNP組中觀察到眼睛大小和身體長(zhǎng)度顯著減少（圖1f和g）。雖然已經(jīng)確定親代PNP暴露會(huì)導(dǎo)致后代幼魚的血流量和心率增加，但根據(jù)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)的結(jié)果，觀察到它會(huì)導(dǎo)致黑暗期的運(yùn)動(dòng)減少（圖1h–k）。另一方面，根據(jù)整株免疫熒光幼魚染色結(jié)果，親代PNP暴露導(dǎo)致下一代幼魚的細(xì)胞死亡和自由氧自由基數(shù)量增加（圖2）。另一方面，由于脂質(zhì)代謝的不規(guī)則性，檢測(cè)到脂質(zhì)積累顯著減少（圖2）。

圖2

在本研究中，為了闡明在胚胎早期暴露于PNP的斑馬魚后代中觀察到的這些形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和分子損傷的潛在機(jī)制，通過(guò)化學(xué)計(jì)量分析評(píng)估Q-TOF MS/MS光譜來(lái)進(jìn)行代謝組分析。在圖中，各組之間存在一定差異（圖3a段）。圖3b中，有兩個(gè)主要集群，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和PNP組之間存在顯著差異。這些代謝物可能因投影變量（VIP）得分而顯著變化（圖3c段）。在圖3c中，下調(diào)和上調(diào)的代謝物分別被闡明為紅色和藍(lán)色。根據(jù)分析結(jié)果，確定酪氨酸、不飽和脂肪酸代謝、葉酸生物合成和精氨酸-脯氨酸代謝受到嚴(yán)重影響（圖3d）。

圖3

代謝組結(jié)果表明，與多巴胺合成密切相關(guān)的3-甲氧基酪胺（3-MT）和高香草酸（HVA）水平在PNP組中顯著上調(diào)（圖3c）。3-MT是多巴胺的主要代謝產(chǎn)物，而HVA是多巴胺分解代謝的主要代謝物。兩種化合物水平的共同增加表明，這可能是與RET原癌基因、多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤類型、Von Hippel-Lindau和整合膜蛋白相關(guān)的幾個(gè)基因發(fā)生遺傳突變的跡象。較低的多巴胺水平和誘導(dǎo)分解代謝機(jī)制可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病。此外，研究表明，多巴胺在腫瘤組織中的濃度低于良性組織，甚至通過(guò)多巴胺治療可以減少慢性應(yīng)激介導(dǎo)的血管生成，從而阻止腫瘤細(xì)胞增殖。

甲基糖胺（creatin），與生物體內(nèi)的許多過(guò)程有關(guān)，包括生理、神經(jīng)、免疫和代謝，被確定為PNP組中具有最高顯著性的上調(diào)代謝產(chǎn)物（圖3c）。高肌酸水平是腎/肌肉疾病和腎功能障礙的標(biāo)志。此外，這種肌肉廢物可能導(dǎo)致血管損傷和高血壓。當(dāng)評(píng)估高血流量和心率以及高肌酸水平時(shí)（圖1和圖3），我們可以說(shuō)父母PNP暴露顯著影響下一代。

為了在分子水平上評(píng)估這些癌癥相關(guān)代謝物水平的變化，對(duì)幼魚進(jìn)行組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)（使用JNK、NOP10、PI3和H2A.X生物標(biāo)志物）分析，并搜索癌癥結(jié)果。根據(jù)組織病理學(xué)結(jié)果，在PS組的幼魚中發(fā)現(xiàn)了嚴(yán)重的神經(jīng)元變性和壞死，特別是在腦組織中，以及血管中具有核多態(tài)性的非典型、深染、增生細(xì)胞（圖4）。另一方面，根據(jù)免疫組織化學(xué)分析結(jié)果，在PS組幼魚中檢測(cè)到顯著更高的免疫陽(yáng)性率，特別是在腦組織JNK和H2A.X表達(dá)中，以及在血管中檢測(cè)到的非典型細(xì)胞中NOP10和PI3表達(dá)中（圖4）。研究表明，JNK與惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)。另一方面，據(jù)報(bào)道，NOP10的表達(dá)水平在腫瘤組織中顯著增加，是轉(zhuǎn)移形成的重要標(biāo)志物。磷脂酰肌醇3（PI3）激酶是一種重要的酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、代謝活性、存活和血管生成中發(fā)揮作用。涉及該酶的病理激活涉及多種機(jī)制，如腫瘤抑制基因的突變和失活。此外，PS組H2A.X免疫陽(yáng)性率增加也是DNA損傷的重要指標(biāo)。在PS組中觀察到的神經(jīng)元損傷和JNK表達(dá)也可以被評(píng)估為細(xì)胞凋亡增加的指標(biāo)。氧化應(yīng)激和隨后由于抗氧化防御系統(tǒng)不足而導(dǎo)致的自由氧物種增加所引起的不可逆損傷將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。因此，根據(jù)全身免疫熒光幼魚染色的結(jié)果（圖2），在PNP組中觀察到的細(xì)胞死亡和自由氧自由基數(shù)量的顯著增加支持了這些發(fā)現(xiàn)。盡管這些不足以直接診斷癌癥，但它們提供了支持癌癥發(fā)現(xiàn)的重要初步信息。

圖4

至于下調(diào)的代謝產(chǎn)物，在PNP組中檢測(cè)到的低肌苷一磷酸（IMP）水平與能量代謝失調(diào)有關(guān)，可能解釋生長(zhǎng)遲緩導(dǎo)致的眼睛大小、身體長(zhǎng)度和運(yùn)動(dòng)活性的差異。PNP組的亞油酸、油酸和二十二碳六烯酸水平顯著較低。這些分子被稱為不飽和脂肪酸（UFA），在細(xì)胞膜中發(fā)揮重要作用，用作能量?jī)?chǔ)存，并參與基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成。膽固醇是脂質(zhì)組織最重要的調(diào)節(jié)因子之一，是PNP組中另一種顯著下調(diào)的代謝產(chǎn)物。當(dāng)將這些發(fā)現(xiàn)與全株免疫熒光幼魚染色分析的脂質(zhì)積累結(jié)果一起評(píng)估時(shí)（圖2），我們可以說(shuō)，親代PNP暴露會(huì)導(dǎo)致下一代脂質(zhì)代謝惡化。

3.結(jié)論
父母接觸聚苯乙烯納米塑料會(huì)導(dǎo)致下一代幼魚生長(zhǎng)遲緩，包括畸形、存活率下降、心率和血流量增加，以及眼睛大小、身高和運(yùn)動(dòng)能力下降。根據(jù)全山免疫熒光幼魚染色的結(jié)果，注射PNP的斑馬魚新一代幼魚的細(xì)胞死亡和活性氧物種顯著增加，而脂質(zhì)積累減少。根據(jù)代謝組學(xué)結(jié)果，檢測(cè)到了OPLS-DA分析提出的28個(gè)注釋代謝組。此外，還發(fā)現(xiàn)新一代幼魚的組織病理學(xué)表現(xiàn)和JNK、H2A.X、PI3和NOP10的免疫陽(yáng)性率顯著增加?？傊?，研究表明，即使僅在胚胎期暴露于PS，也可能影響下一代許多與癌癥相關(guān)的過(guò)程。

參考文獻(xiàn)
Sulukan E, ?enol O, Baran A, et al. Nano-sized polystyrene plastic particles affect many cancer-related biological processes even in the next generations; zebrafish modeling[J]. Science of The Total Environment, 2022, 838: 156391.


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